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PCR技術


錄入時間:2015-4-8 9:44:57 來源:青島海博生物

  PCR: Polymerase chain reaction,即聚合酶鏈反應是80年代中期發展起來的體外核酸擴增技術

PCR技術的發展歷史

  1985年關于PCR 的文章首次由美國科學家Kary Mullis等人在 《Science》雜志上發表 。

  1989年《Science》雜志報道了耐熱性DNA多聚酶 Taq酶(生活在溫泉中的水生嗜熱桿菌內提取到的一種耐熱的DNA聚合酶 )的發現,預示著分子時代的到來。12月《Science》雜志將PCR和它所使用的聚合酶命名為第一個“年度分子”。

1993年Kary Mullis 因PCR的發明獲得諾貝爾化學獎。

PCR技術的原理 

  遺傳物質由細胞核、染色體、DNA(脫氧核糖核酸和磷酸鏈和堿基構成)、堿基(A、T、C、G)是按雙鏈螺旋排列的,堿基序列的長度和排列的順序決定了生物的多樣性。比如人類體細胞中共有31億個堿基對,按上述的0.1%的差,人和人之間有3百萬個堿基對的差別。 

  PCR的基本工作原理就是以擬擴增的DNA分子為模板,以一對分別與模板互補的寡核苷酸片段為引物,在DNA聚合酶的作用下,按照半保留復制的機理沿著模板鏈延伸直至完成新的DNA合成。

  PCR反應的基本成分包括7種基本成分:模板DNA、特異性引物、熱穩定DNA聚合酶、脫氧核苷三磷酸(dNTP)、二價陽離子、緩沖液及一價陽離子。基本反應步驟 :變性--退火--延伸。最后通過染料如EB染色DNA后在紫外燈下顯色檢出。

PCR技術的注意事項

1、防止污染,建立良好的質量控制。操作時避免氣溶膠產生,特別注意陽性樣品的拿放,使用一次性耗材,穿戴手套并經常更換,永遠在最后一步才加核酸,液體分裝使用等。

2、引物設計合理。

3、Taq酶擴增錯誤率較高,大約1/100對堿基/20個循環。

4、鎂離子濃度對反應效率的影響。

5、儀器穩定性,升降溫速率,管子的密合度等。

6、RT-PCR注意防止RNA降解。

 

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